Enzymologie C8160

Enzymologie je povinným předmětem v prvním semestru magisterského studia biochemie. Jelikož začátek semestru už pomalu klepe na dveře, průběžně sem budu přidávat informace z přednášek. Mezitím si můžete níže prohlédnout osnovu předmětu. Postupně budu doplňovat i výpisky, které budou vycházet hlavně z přednášek prof. Kučery a dále ze skript Enzymologie prof. Vodrážka a kol. (1998). Katalog předmětu (a tedy i další informace) najdete na tomto odkazu.

Historie enzymologie. Stavba enzymů. Pojmy: holoenzym, apoenzym, kofaktor, koenzym, kosubstrát, prostetická skupina. Charakteristické rysy enzymové katalýzy. Možnosti regulace enzymů in vivo. Mnohočetné formy enzymů (izoenzymy, konjugované enzymy, polymerní enzymy), multienzymy (multienzymové komplexy, polypeptidy). Názvosloví enzymů.

2. Enzymová aktivita
Závislost rychlosti enzymové reakce na koncentraci enzymu a substrátu. Aktivita, molekulová aktivita, aktivita katalytického místa, katalytická koncentrace, specifická aktivita. Používání konvenčních jednotek enzymové aktivity. Přímé a nepřímé měření aktivity, spřažené enzymové reakce. Možnosti monitorování průběhu enzymové reakce, příklady syntetických substrátů pro fotometrii, fluorimetrii a luminometrii.

3. Izolace enzymů
Živočišné, rostlinné a mikrobiální zdroje enzymů. Uvolňování intracelulárních enzymů z buněk, zahušťování extraktu, výběr separačních technik, konečné úpravy. Kvantitativní hodnocení purifikačního postupu. Krystalizace enzymů. Kriteria čistoty enzymových preparátů. Faktory ovlivňující stabilitu enzymových preparátů, možnosti stabilizace.

4. Chemické mechanismy enzymové katalýzy
Acidobazická katalýza, nukleofilní a elektrofilní katalýza. Kovalentní katalýza. Příklady účasti konkrétních aminokyselinových zbytků a kofaktorů. Radikálové reakce enzymů. Konvergence, divergence, paralelismus a zvrat funkce v evoluci katalytického mechanismu.

5. Termodynamika a kinetika přeměny substrátu na produkt
Tvorba komplexu enzymu se substrátem. Energetický profil nekatalyzované a katalyzované reakce, možnosti ovlivnění aktivační energie. Kinetika reakčního mechanismu Michaelise a Mentenové (prestacionární stadium, stacionární a rovnovážné přiblížení). Rovnice Michaelise a Mentenové v diferenciálním a integrovaném tvaru. Význam kinetických parametrů V_max (V_lim), K_m a V_max/K_m. Rverzibilní forma mechanismu Michaelise a Mentenové. Haldanův vztah.

6. Teoretické základy enzymové kinetiky
Použití teorie grafů při odvozování kinetických rovnic ve stacionárním, rovnovážném a blokově rovnovážném přiblížení. Grafické a výpočetní metody analýzy experimentálních kinetických dat. Software pro enzymovou kinetiku.

Vliv teploty, pH, iontové síly a viskozity.

Typy reverzibilní inhibice v Botts-Moralesově schématu a jejich diagnostika. Inhibice substrátem a produktem. Vysokoafinitní reverzibilní inhibitory. Ireverzibilní inhibice - afinitní značení, inaktivace závislá na reakčním mechanismu. Analoga přechodového stavu. Farmakologický význam inhibitorů. Návrh nových účinných inhibitorů.

Klasifikace kinetických mechanismů vícesubstrátových reakcí. Clelandova symbolika. Kinetické rovnice. Experimentální rozlišení mezi jednotlivými mechanismy. Primární a sekundární grafy, inhibice produkty, analogy substrátů, izotopová výměna.

10. Kooperativní jevy při působení enzymů
Definice kooperativity. Homeotropní a heterotropní kooperativita, allosterie. Určení stupně kooperativity. Hillova rovnice, Hillův koeficient. Fenomenologický rovnovážný model, Adairova rovnice. Molekulové modely Monod-Wyman_Changeux a Koshland-Nemethy-Filmer a jejich zobecnění. Asociace-disociace oligomeru. Kinetická kooperativita a kooperativita v monomerních enzymech. Pseudokooperativita a její možné příčiny

11. Enzymy na pevných površích a micelách
Metody imobilizace enzymů. Vliv imobilizace na kinetické parametry, pH optimum, teplotní závislost aktivity na stabilitu enzymu. Kinetické modely reaktorů s imobilizovaným enzymem. Micelární systémy - příprava, kinetické vlastnosti, možnosti použití.

12. Enzymy v biochemické analytice
Stanovení analytů s použitím rozpustných enzymů. Nerovnovážné metody (měření počáteční rychlosti, konverze na produkt za fixní čas, dvouenzymové a jednoenzymové recyklizační systémy), rovnovážné metody (do konečného bodu, izotoppová výměna za rovnováhy). Enzymové biosenzory - rozdělené podle měřené elektrické veličiny, analytické charakteristiky, příklady použití. Enzymová imunoanalýza. Enzymy jako markery genové exprese.

13. Další vývoj použití enzymů, enzymové inženýrství
Nejdůležitější prakticky používané enzymy. Příklady uplatnění (potravinářství, krmivářství, výroba pracích prostředků, organická syntéza, medicína aj.). Extremofilové jako zdroje enzymů. Využití strukturních dat k optimalizaci enzymové funkce. Cílená evoluce genů.

Literatura:

MACHOLÁN, Lumír. Enzymologie. 2. upr. vyd. Brno: Vydavatelství Masarykovy univerzity, 1994. 152 s. ISBN 8021010398. info
KOTYK, Arnošt a Jaroslav HORÁK. Enzymová kinetika. 1. vyd. Praha: Academia, 1977. 268 s. info

Žádné komentáře:

Okomentovat

Přihlásit se k odběru: Příspěvky (Atom)