Inhibice enzymových reakcí

Obsah

• Inhibitory
• Velikost inhibice
• Účinnost inhibice
• Klasifikace inhibicí
• Plné reverzibilní inhibice
• Kompetitivní inhibice
• Nekompetitivní inhibice
• Akompetitivní inhibice
• Směsná inhibice
• Jak podle grafu poznat, o kterou inhibice se jedná?
• Parciální inhibice
• Inhibice substrátem
• Inhibice produktem
• Pevně vázané reverzibilní inhibitory
• Pomalé inhibice
• Ireverzibilní inhibice

Inhibitory

Inhibitory jsou látky, které v nízkých koncentracích snižují rychlost enzymových reakcí. Co se myslí "nízkou koncentrací"? Nejlepší inhibitory zpomalují reakce již v jednotkách nM (nanomolární) koncentrace. Poměrně dobré jsou i ty inhibitory, které fungují při μM koncentraci. Naopak slabé jsou inhibitory, které pracují v mM koncentraci.

Velikost inhibice

Velikost inhibice se zjišťuje porovnáním neinhibované a inhibované reakce:

I = 1 -	vi	(*100 %)
	vo

Účinnost inhibice

Účinnost inhibice lze vyjádřit dvěma veličinami: konstantou 50 % inhibice I₅₀, IC₅₀ a termodynamickou inhibiční konstantou K_i. K_i souvisí s energetickou změnou při vazbě inhibitoru I na určitou formu enzymu E:

Ki =	[Ej][I]
	[EjI]

Klasifikace inhibicí

Inhibice lze rozdělit podle několika hledisek:

• reverzibilní (vratné), ireverzibilní (nevratné)
• podle pevnosti vazby: volně vázané inhibitory (c_i >> c_E), pevně vázané inhibitory (c_i ≈ c_E)
• rychlé inhibice, pomalé inhibice
• plné inhibice (při vysoké koncentraci inhibitoru reakce neprobíhá - běží nulovou rychlostí), parciální (= hyperbolické) inhibice

Plné reverzibilní inhibice

Nejdříve si ukážeme základní popis plných reverzibilních inhibic (reverzibilní = vratné):

Toto je schéma, jak tento typ inhibice probíhá. Inhibitor se může navázat jak na volný enzym, tak i na enzym ve formě ES (na enzymu je již navázaný substrát). Od toho se odvíjí i dvě různé konstanty popisující inhibici: K_is pro navázání inhibitoru na volný enzym, K_ii pro navázání inhibitoru na komplex enzym-substrát.

Nyní si rovnice rozebereme. Z předchozích kapitol již víme, že rychlost se rovná disociační konstantě krát koncentrace komplexu enzym-substrát. U inhibic musíme tento vzorec upravit. Stejně jako u "obyčejných" reakcí i zde platí, že nejpomalejší krok je rychlost určující krok, proto se od tohoto bude odvíjet i rychlost inhibované reakce (v_i). Disociační konstanta ve vzorci zůstává, násobí se také celkovou koncentrací enzymu, nutno je ale ještě přidat výše uvedený zlomek právě kvůli inhibici a kvůli tomu, že inhibitor může reagovat na více místech reakce. V čitateli zlomku se nachází koncentrace komplexu enzym-substrát (rychlost určující krok), ve jmenovateli pak nacházíme všechny formy enzymu, ke kterým může v inhibované reakci dojít.

Kde se najednou vzala všechna ta S, I a K_něco? Inu, to je prosté, milý Watsone... Stačí si podle výše uvedeného schématu jednotlivé veličiny vyjádřit:

Pak už jen stačí dosadit do původního vzorce, vykrátit [E], vynásobit čitatel i jmenovatel K_M a vytknout K_M a [S]:

Závislost rychlosti inhibované reakce na koncentraci substrátu se vyjadřuje pomocí modifikované rovnice Michaelise a Mentenové, přičemž v_lim´ a K_M´ jsou funkcemi koncentrace inhibitoru (u jiné koncentrace budou mít i jiné číselné hodnoty):

Plné reverzibilní inhibice lze rozlišit podle mechanismu na 4 druhy: kompetitivní, nekompetitivní, akompetitivní a směsná.

Kompetitivní (competitive) inhibice

U kompetitivní inhibice se inhibitor váže na volný enzym, víceméně soutěží se substrátem, kdo se naváže (proto kompetitivní - od slova kompetice = soutěž).

Mezi kompetitivní inhibitory patří: interní analoga substrátů a kompetující substráty. Mezi interní analoga substrátů lze zařadit malonát, který inhibuje enzym sukcinátdehydrogenázu katalyzující přeměnu sukcinátu na fumarát. Dalším analogem je UpcA, který inhibuje ribonukleázu. Mezi navzájem kompetující substráty patří ethanol a ethylenglykol, které jsou katalyzovány enzymem alkoholdehydrogenáza.

Nekompetitivní inhibice

Akompetitivní inhibice

Na první pohled by se mohlo zdát, že mezi nekompetitivní a akompetitivní inhibicí není rozdíl. Opak je však pravdou, jeden velký by se našel. U nekompetitivní inhibice inhibitor se substrátem nesoutěží o navázání na enzym, nýbrž se naváže poté, co se navázal substrát. U akompetitivní inhibice je inhibitoru úplně jedno, jestli je na enzymu substrát již navázaný či nikoliv, prostě se naváže tak jako tak. Dalo by se tedy říct, že akompetitivní inhibitor je ze všech tří ten nejméně vybíravý.

Směsná inhibice

Směsná inhibice je, jak už název napovídá, kombinací předchozích druhů inhibic.

Jak podle grafu poznat, o kterou inhibici se jedná?

Je to jednoduché. Stačí si zapamatovat jednotlivé grafy nebo aspoň kde leží průsečík přímek vynesení s osami:

• U kompetitivní inhibice se průsečík protíná s osou y.
• U nekompetitivní inhibice průsečík leží na ose x.
• U akompetitivní inhibice nenalezneme žádný průsečík, protože přímky jsou rovnoběžné.
• No a u směsné inhibice se průsečík nachází mimo osy.

Parciální inhibice

Jistě jste si všimli, že u schématu nám přibyla část za ESI. Parciální inhibice jsou totiž charakteristické tím, že i při vysoké koncentraci inhibitoru se tvoří produkt, takže reakce probíhá, a to i v případě, že je inhibitor navázán na komplex enzym-substrát. Proto i následné výpočty a rovnice jsou o malinko složitější, přesto jsou principiálně podobné, takže pokud víte, jak na plné inhibice, neměly by vám parciální inhibice dělat problém.

Inhibice substrátem

Inhibice produktem

Pevně vázané reverzibilní inhibitory

Nejprve si vyjádříme koncentraci volného inhibitoru. K tomu použijeme reakční rychlosti v_i a v_o:

Nyní si vezmeme na pomoc rychlostní rovnici pro plnou reverzibilní inhibici:

Po dosazení ϑ do rovnice vyjadřující 50 % inhibici dostáváme:

Jak jsme se dostali k tvarům druhů inhibic na obrázku výše? Vraťme se k tomu, které vztahy mezi konstantami jsou pro jednotlivé inhibice typické:

• kompetitivní:  celý člen s K_ii tedy můžeme zanedbat, přičemž dostáváme tento vztah: 
  
  
  
• nekompetitivní:  zde se inhibiční konstanty rovnají, proto jsou ve výpočtu obě označeny jako K_i: 
  
• akompetitivní:  zde je princip podobný jako u kompetitivní inhibice až na to, že nezanedbáváme K_ii, ale K_is: 
  

To, co jsme si doteď uvedli, platí pro koncentraci volného inhibitoru. Jak to bude ale vypadat v případě vázaného inhibitoru? Pojďme se na to společně podívat:

Celková koncentrace inhibitoru je pak součtem jak volného, tak vázaného inhibitoru:

Aby se nám dobře počítalo, lze reverzibilní inhibice linearizovat (výše). Nejinak je tomu i v případě, kdy se použijí pevně vázané inhibitory:

Pomalé inhibice

Co napsat k pomalým inhibicím? Kromě toho, že probíhají pomalu?

Ireverzibilní inhibice

Ireverzibilní inhibice jsou inhibice, kdy se inhibitor váže na enzym většinou kovalentní vazbou, a to většinou nevratně. Tohoto lze využít například u afinitního značení nebo u tzv. sebevražedných substrátů, kdy si enzym myslí, že inhibitor je ve skutečnosti jeho substrát (strukturní podobnost). Reakcí vzniká velmi reaktivní meziprodukt, který se buď rozpadne a nic už se neděje, většinou ale dochází k likvidaci enzymu.

Ireverzibilní inhibice je charakteristická kinetikou prvního řádu:

Její využití najdeme zejména v modifikaci funkčních skupin (jsou zde uvedeny látky, které tu určitou funkční skupina na enzymu jsou schopny modifikovat):

• Karboxylové skupiny: karbodiimidy, alkyloxoniové soli
• Aminoskupiny: aldehydy (pyridoxalfosfát), fenylisothiokyanát, anhydridy
• Thiolové skupiny: jodacetamid, p-chlormerkuribenzoát, N-ethylamaleinimid, kyselina 5,5´-dithiobis(2-nitrobenzoová)
• Hydroxylové skupiny: diisopropylfluorofosfonát, fenylmethansulfonylfluorid
• Imidazolové skupiny: diethylester kyseliny diuhličité ("pyrouhličité")
• Fenolové skupiny: N-acetylimidazol, tetranitromethan
• Guanidinové skupiny: diacetyl, fenylglyoxal

Také se využívá pro afinitní značení:

• endoafinitní: 
  
• exoafinitní 
  
• fotoafinitní 
  

U fotoafinitního značení je nutná fotochemická aktivace navázaného ligandu pomocí UV záření. 

Zdroje

Přednášky pana profesora Kučery a vlastní poznámky

http://www.studiumbiochemie.cz/prirodni_latky_enzymy.html

Diplomová práce Sledování kinetiky inhibitorů acetylcholinesterázy in vitro, autorka Kateřina Janská

https://is.muni.cz/el/1431/podzim2012/C5990/um/APENZ7_Vicesubstratove_reakce.pdf

https://is.muni.cz/el/1431/podzim2012/C5990/um/APENZ6_Inhibice.pdf